Western Blot 试验中的标准（表达量）参照物即内参，有了参照物才能准确地比较目的蛋白表达量的差异。内参一般选用管家基因表达的蛋白，它们在各个组织细胞中表达相对恒定，不会因为外部条件变化而引起表达量的变化。而且内参可以监测整个试验体系是否正常，比如蛋白提取过程，转膜体系，显色体系等。

WB为什么必须要用内参？

要检测一个基因是否有表达，或者比较表达水平的变化，首选方式是Western Blot。因为Western Blot操作相对简单，既可以定性分析表达产物，还可以检测目的蛋白量的相对变化。在实验中，可能存在总蛋白浓度测定不准确，或者蛋白质样品在上样时产生的操作误差。特别表达量不高时，蛋白定量或上样的误差很有可能影响结果的分析。

为了校正这个误差，Western Blot实验都需要进行内参检测。具体校正方法就是将每个样品目的含量与内参含量相除，得到每个样品目的蛋白的相对含量。再进行样品与样品之间的比较。

如何选择内参？

内参抗体种类很多，比如β-actin、β-tubunlin、GAPDH、Lamin B等，那么针对自己的实验，我们该如何选择呢?下面简单介绍下选择内参抗体应遵循的原则：

1.样本种属来源

首先要考虑的就是实验样本来源于什么物种。

(1)哺乳动物的组织或者细胞样本，通常选择β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Histone H3、Na,Katpase等。

(2)植物来源实验样本，则可以选择plant actin、Rubisco等。

(3)其他来源样本研究较少，所以就应该参照文献报导，选择合适的蛋白作为内参。

2.目的蛋白分子量

选择内参抗体时，应该考虑目的蛋白分子量的大小。通常应该保证目的蛋白与内参蛋白分子量相差5KD以上。比如目的蛋白分子量为45KD，此时不适宜选择β-actin作为内参，可以考虑选择GAPDH或者β-tubulin作为内参。

3.目的蛋白表达部位

就一般的蛋白检测来说，β-actin、β-Tubulin抗体等就可以了，而针对于核蛋白的定量，特别是样本蛋白就是核蛋白时，选择恰当的核蛋白内参则更能体现内部参照的价值。常用的核内参抗体有Lamin A、Lamin B、Histone H3，除此之外，其它常见的核蛋白内参还有PCNA、K70、K80等，在一些文献报道中，Erk2、TATA binding protein(TBP)以及c-Jun、c-Fos等都有使用。而对于膜蛋白检测，常用的内参抗体为Na,K ATPase。对于线粒体蛋白的检测，常用VDAC1和COX IV作为内参抗体。

常用三大内参

1.beta Actin

肌动蛋白，细胞骨架蛋白。它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。beta Actin 作为内参是得到公认的，针对大多数组织和细胞来说的，它广泛分布于细胞质内，表达量非常丰富。但是在一些少量特殊的情况下比如脂肪组织和细胞内，beta Actin 的表达量就很少。

2.GAPDH

甘油醛-3-磷酸脱氢酶，该酶是糖酵解反应中的一个酶，几乎在所有组织细胞中都高水平表达，在同种细胞或组织中的表达量一般是恒定的，且很少受外部诱导物的影响。但比如缺氧和糖尿病等疾病存在下，会增加 GAPDH 在特定细胞和组织中的表达。

3.beta Tubulin

微管蛋白，细胞骨架蛋白。作为内参抗体，beta Tubulin 表达通常不会发生改变，因此被广泛用于 Western Blot 内参，也常被用于免疫染色观察细胞的微管结构。

内参使用注意事项

▲1. 不同的内参在选择上也要根据具体的样本情况选择，没有一种内参能适用所有的组织和细胞样本。比如，血红细胞（因为其细胞结构的特殊性和需要携带氧气的功能性）样本就不适合以上 3 种常用内参。如果使用会导致结果很差或者没有结果。可以选用血红细胞的结构性蛋白作为内参代替。

▲2. 在做多组织多细胞样本对比表达量时，最好选用 GAPDH 作为内参，因为 GAPDH 是代谢类蛋白，在活组织中表达比较恒定。而 beta Actin 和 beta Tubulin 是结构蛋白，不同组织的细胞结构会有差异性，如脑组织的 tubulin 的表达会高一些（因为神经细胞的轴突和树突都由 tubulin 维持结构），而 actin 的表达量可能会低一些。再比如，骨骼肌、心肌和平滑肌的特殊功能反而导致了 tubulin 的表达改变和特化。心肌的 beta Actin 的表达量可能变少，而 alpha Actin 表达量高。因为这些组织的差异，现在慢慢采用总 Actin 和总 tubulin 作为内参，可以尽量减少一些组织表达量差异。

▲3. 做各种分泌液样本的时候，如血浆，乳汁，组织液等，以上的 3 种内参也不是很合适。由于没有完整的细胞结构，所以只能选择一些分泌蛋白作为内参，或者采用其他方式作为内参。

▲4. 做诱导后样本或检测磷酸化等修饰性抗体时，选择结构蛋白作为内参，如 beta Actin 和 beta Tubulin。因为 GAPDH 是代谢类蛋白，表达量有可能会受到诱导处理的影响。同时，做修饰性抗体的 Western Blot 实验，最好也带上同抗原的总抗作为阳性对照。

▲5. 做 Western Blot 实验时，内参的条带强度也要适当控制。不要让内参条带发生过度曝光的情况，尤其是用 X 胶片曝光的。如果内参条带过度曝光，条带会显得很宽，妨碍对条带正确强度的判读，进而影响对其他实验结果的判断。最好的内参结果是： 窄窄的，黑色实心条带。

另一面，如用弱界面活性剂溶解细胞，就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果，抗原决定族被封闭，影响与抗体的结合，即使IP成功，也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。

文章出自 科研实验外包   想了解更多请关注：http://www.dj-cro.com/